Evaluation of skimmed milk flocculation method for virus recovery from tomatoes

Abstract This study aimed to evaluate the elution-concentration methodology based on skimmed milk flocculation from three varieties of tomatoes (Solanum lycopersicum L. [globe], Solanum lycopersicum var. cerasiforme [cherry] and hybrid cocktail [grape tomato]) for further monitoring of field samples. Spiking experiments were performed to determine the success rate and efficiency recovery of human norovirus (NoV) genogroup II, norovirus murine-1 (MNV-1) used as sample process control virus and human adenovirus (HAdV). Mean values of 18.8%, 2.8% and 44.0% were observed for NoV GII, MNV-1 and HAdV, respectively with differences according to the types of tomatoes, with lower efficiency for cherry tomatoes. Analysis of 90 samples, obtained at commercial establishments in the metropolitan region of Rio de Janeiro State, revealed 4.5% positivity for HAdV. Bacterial analysis was also performed with no detection of Salmonella spp., L. monocytogenes and fecal coliforms. Data demonstrated that the skimmed milk flocculation method is suitable for recovering HAdV from tomatoes and highlights the need for considering investigation in order to improve food safety.

Evaluation of skimmed milk flocculation method for virus recovery from tomatoes

Abstract This study aimed to evaluate the elution-concentration methodology based on skimmed milk flocculation from three varieties of tomatoes (Solanum lycopersicum L. [globe], Solanum lycopersicum var. cerasiforme [cherry] and hybrid cocktail [grape tomato]) for further monitoring of field samples. Spiking experiments were performed to determine the success rate and efficiency recovery of human norovirus (NoV) genogroup II, norovirus murine-1 (MNV-1) used as sample process control virus and human adenovirus (HAdV). Mean values of 18.8%, 2.8% and 44.0% were observed for NoV GII, MNV-1 and HAdV, respectively with differences according to the types of tomatoes, with lower efficiency for cherry tomatoes. Analysis of 90 samples, obtained at commercial establishments in the metropolitan region of Rio de Janeiro State, revealed 4.5% positivity for HAdV. Bacterial analysis was also performed with no detection of Salmonella spp., L. monocytogenes and fecal coliforms. Data demonstrated that the skimmed milk flocculation method is suitable for recovering HAdV from tomatoes and highlights the need for considering investigation in order to improve food safety.

Identificação de Cronobacter spp. em queijos e perfil de suscetibilidade antimicrobiana / Identification of Cronobacter spp. in cheeses and the antimicrobial susceptibility profile

Cronobacter spp. é um patógeno oportunista que pode causar infecções em indivíduos de qualquer idade, cuja incidência é maior em neonatos, pacientes imunocomprometidos e idosos. Neste estudo Cronobacter spp. foi pesquisado em 90 amostras de queijos (30 do tipo Minas Frescal, 30 do tipo Prato e 30 do tipo Prato fatiado). As espécies isoladas foram identificadas, e foi avaliado o perfil de suscetibilidade a antimicrobianos. A pesquisa foi realizada utilizando-se pré-enriquecimento em água peptonada tamponada, enriquecimento seletivo no caldo lauril sulfato triptose contendo vancomicina, isolamento no meio Enterobacter sakazakii Isolation Agar e identificação no Vitek 2.0. As espécies foram identificadas por meio de múltipla PCR com alvo no gene cgcA. O antibiograma foi realizado pela técnica de difusão em ágar (Kirby-Bauer). Cronobacter spp. foi isolada em uma (1,1 %) amostra de queijo tipo Minas Frescal, identificada como C. sakazakii que apresentou sensibilidade a todos os antimicrobianos testados. Cronobacter spp. pode nمo representar risco à saْde dos indivíduos pelo consumo de queijos produzidos com leite pasteurizado. Entretanto, a presença de Cronobacter spp. em uma amostra de queijo demonstra falhas na produção, o que reforça a necessidade de maior adesão às Boas Práticas de Fabricação.

Cronobacter spp. is an opportunistic pathogen that may cause infections in individuals ofany age, and the highest incidence occurs in neonates, immunocompromised patients andelderly persons. This study investigated Cronobacter spp. occurrence in 90 cheese samples(30 “Minas Frescal” type cheeses, 30 “Prato” type and 30 sliced “Prato” type). The isolatedspecies were identified and the antimicrobial susceptibility profile of the isolated strains wasevaluated. The microbiological assay was performed with pre-enrichment in buffered peptonewater, and selective-enrichment in modified lauryl sulphate tryptose broth containingvancomycin. Isolation and identification were done in Enterobacter sakazakii Isolation Agar andin Vitek 2.0, respectively. The species identification was performed by multiple PCR targetingcgaA gene. Antibiogram was done using agar diffusion method (Kirby-Bauer). Cronobacter spp.was isolated from one (1.1 %) sample of “Minas Frescal” type cheese, identified as C. sakazakii which was sensitive to all of tested antimicrobials. Cronobacter spp. does not represent arisk to the individuals health by consuming cheeses made from pasteurized milk. However,the presence of Cronobacter spp. in one sample of analyzed cheese indicates failures in their production, reinforcing the need for following the Good Manufacturing Practices.

Pesquisa, identificação e perfil de suscetibilidade antimicrobiana de Cronobacter spp. em produtos destinados à alimentação infantil / Detection, identification and antimicrobial susceptibility profile of Cronobacter spp. in products for infant feeding

Cronobacter spp. emergiu como perigo microbiológico em fórmulas infantis desidratadas (FID), responsável por infecções graves em neonatos. Contudo, muitos pacientes não ingeriram FID, o que indica que outros alimentos podem atuar como veículo do patógeno. Os objetivos deste estudo foram pesquisar Cronobacter spp. em alimentos infantis, identificar as espécies e avaliar o perfil de suscetibilidade aos antimicrobianos das cepas isoladas. Foram analisadas 47 amostras pré-cozidas de cereais à base de grãos, amidos de milho e farinhas lácteas. A pesquisa foi realizada com pré-enriquecimento em água peptonada tamponada, enriquecimento seletivo no Cronobacter Screening Broth, isolamento por meio de Enterobacter sakazakii Isolation Agar e identificação no Vitek 2.0. A identificação das espécies foi realizada por reação em cadeia pela polimerase com alvo nos genes rpoB e cgcA. O antibiograma foi realizado pelo método de difusão em ágar (Kirby-Bauer). Cronobacter spp. foi identificada em 11 amostras (23,4 %). Oito cepas foram identificadas como C. sakazakii (72,7 %), duas como C. malonaticus (18,2 %) e uma como C. dublinensis (9,1 %). Apenas uma cepa de C. malonaticus apresentou resistência intermediária a ciprofloxacina. Os produtos destinados à alimentação infantil avaliados podem apresentar risco, no caso destes alimentos serem ingeridos por pacientes pertencentes ao grupo de risco, como neonatos e idosos.

Cronobacter spp. emerged as a microbiological hazard in powdered infant formulas (PIF)causing severe infections in newborns. However, among these patients many of them had not ingested PIF indicating that other foods categories might be as the pathogen vehicle. This study aimed at investigating Cronobacter spp. in infant foods, identifying the species and evaluatingthe antimicrobial susceptibility profile of the isolated strains. Forty-seven samples of precooked grain-based cereals, corn starch and milk flours were analyzed. The microbiological analysis was performed with pre-enrichment in buffered peptone water, followed by selective-enrichment in Cronobacter Screening Broth, isolation in Enterobacter sakazakii Isolation Agar and identificationin Vitek 2.0. The identification of species was performed by polymerase chain reaction targetingrpoB and cgaA genes. The antibiogram was carried out using the agar diffusion method(Kirby-Bauer). Cronobacter spp. was identified in 11 samples (23.4 %). Eight strains wereidentified as C. sakazakii (72.7 %), two as C. malonaticus (18.2 %) and one as C. dublinensis (9.1 %). Only one C. malonaticus strain showed an intermediate resistance to ciprofloxacin. The evaluated samples produced for infant feeding might cause hazard when ingested by patients belonging tothe risk group as newborns and elderly.

Pesquisa, identificação e perfil de suscetibilidade antimicrobiana de Cronobacter spp. em produtos destinados à alimentação infantil / Detection, identification and antimicrobial susceptibility profile of Cronobacter spp. in products for infant feeding

Cronobacter spp. emergiu como perigo microbiológico em fórmulas infantis desidratadas (FID), responsável por infecções graves em neonatos. Contudo, muitos pacientes não ingeriram FID, o que indica que outros alimentos podem atuar como veículo do patógeno. Os objetivos deste estudo foram pesquisar Cronobacter spp. em alimentos infantis, identificar as espécies e avaliar o perfil de suscetibilidade aos antimicrobianos das cepas isoladas. Foram analisadas 47 amostras pré-cozidas de cereais à base de grãos, amidos de milho e farinhas lácteas. A pesquisa foi realizada com pré-enriquecimento em água peptonada tamponada, enriquecimento seletivo no Cronobacter Screening Broth, isolamento por meio de Enterobacter sakazakii Isolation Agar e identificação no Vitek 2.0. A identificação das espécies foi realizada por reação em cadeia pela polimerase com alvo nos genes rpoB e cgcA. O antibiograma foi realizado pelo método de difusão em ágar (Kirby-Bauer). Cronobacter spp. foi identificada em 11 amostras (23,4 %). Oito cepas foram identificadas como C. sakazakii (72,7 %), duas como C. malonaticus (18,2 %) e uma como C. dublinensis (9,1 %). Apenas uma cepa de C. malonaticus apresentou resistência intermediária a ciprofloxacina. Os produtos destinados à alimentação infantil avaliados podem apresentar risco, no caso destes alimentos serem ingeridos por pacientes pertencentes ao grupo de risco, como neonatos e idosos.

Cronobacter spp. emerged as a microbiological hazard in powdered infant formulas (PIF) causing severe infections in newborns. However, among these patients many of them had not ingested PIF indicating that other foods categories might be as the pathogen vehicle. This study aimed at investigating Cronobacter spp. in infant foods, identifying the species and evaluating the antimicrobial susceptibility profile of the isolated strains. Forty-seven samples of precooked grain-based cereals, corn starch and milk flours were analyzed. The microbiological analysis was performed with pre-enrichment in buffered peptone water, followed by selective-enrichment in Cronobacter Screening Broth, isolation in Enterobacter sakazakii Isolation Agar and identification in Vitek 2.0. The identification of species was performed by polymerase chain reaction targeting rpoB and cgaA genes. The antibiogram was carried out using the agar diffusion method (Kirby-Bauer). Cronobacter spp. was identified in 11 samples (23.4 %). Eight strains were identified as C. sakazakii (72.7 %), two as C. malonaticus (18.2 %) and one as C. dublinensis (9.1 %). Only one C. malonaticus strain showed an intermediate resistance to ciprofloxacin. The evaluated samples produced for infant feeding might cause hazard when ingested by patients belonging to the risk group as newborns and elderly.

Identificação de Cronobacter spp. em queijos e perfil de suscetibilidade antimicrobiana / Identification of Cronobacter spp. in cheeses and the antimicrobial susceptibility profile

Cronobacter spp. é um patógeno oportunista que pode causar infecções em indivíduos de qualquer idade, cuja incidência é maior em neonatos, pacientes imunocomprometidos e idosos. Neste estudo Cronobacter spp. foi pesquisado em 90 amostras de queijos (30 do tipo Minas Frescal, 30 do tipo Prato e 30 do tipo Prato fatiado). As espécies isoladas foram identificadas, e foi avaliado o perfil de suscetibilidade a antimicrobianos. A pesquisa foi realizada utilizando-se pré-enriquecimento em água peptonada tamponada, enriquecimento seletivo no caldo lauril sulfato triptose contendo vancomicina, isolamento no meio Enterobacter sakazakii Isolation Agar e identificação no Vitek 2.0. As espécies foram identificadas por meio de múltipla PCR com alvo no gene cgcA. O antibiograma foi realizado pela técnica de difusão em ágar (KirbyBauer). Cronobacter spp. foi isolada em uma (1,1 %) amostra de queijo tipo Minas Frescal, identificada como C. sakazakii que apresentou sensibilidade a todos os antimicrobianos testados. Cronobacter spp. pode não representar risco à saúde dos indivíduos pelo consumo de queijos produzidos com leite pasteurizado. Entretanto, a presença de Cronobacter spp. em uma amostra de queijo demonstra falhas na produção, o que reforça a necessidade de maior adesão às Boas Práticas de Fabricação.

Cronobacter spp. is an opportunistic pathogen that may cause infections in individuals of any age, and the highest incidence occurs in neonates, immunocompromised patients and elderly persons. This study investigated Cronobacter spp. occurrence in 90 cheese samples (30 “Minas Frescal” type cheeses, 30 “Prato” type and 30 sliced “Prato” type). The isolated species were identified and the antimicrobial susceptibility profile of the isolated strains was evaluated. The microbiological assay was performed with pre-enrichment in buffered peptone water, and selective-enrichment in modified lauryl sulphate tryptose broth containing vancomycin. Isolation and identification were done in Enterobacter sakazakii Isolation Agar and in Vitek 2.0, respectively. The species identification was performed by multiple PCR targeting cgaA gene. Antibiogram was done using agar diffusion method (Kirby-Bauer). Cronobacter spp. was isolated from one (1.1 %) sample of “Minas Frescal” type cheese, identified as C. sakazakii which was sensitive to all of tested antimicrobials. Cronobacter spp. does not represent a risk to the individuals health by consuming cheeses made from pasteurized milk. However, the presence of Cronobacter spp. in one sample of analyzed cheese indicates failures in their production, reinforcing the need for following the Good Manufacturing Practices.

Pesquisa de Cronobacter spp. em fórmulas infantis desidratadas / Screening the dehydrated powdered infant formulae for Cronobacter spp

Cronobacter spp. é uma bactéria oportunista associada a surtos de infecção em neonatos e criançasem virtude de consumo de fórmulas infantis desidratadas (FID). Neste contexto, o setor reguladortem criado normas específicas para o controle destes agentes patogênicos nas fórmulas infantis. Nesteestudo foi pesquisada a ocorrência de Cronobacter spp. em 60 amostras de FID comercializadas no Riode Janeiro, Brasil. Foram analisadas 30 amostras de fórmulas infantis para lactantes (0-6 meses) e 30 defórmulas infantis de seguimento para lactantes (> 6 meses) seguindo-se a metodologia de cultivo descritano Bacteriological Analytical Manual Online–FDA (2012). A identificação das colônias característicasfoi realizada com uso de kits ID32E, API20E e do sistema Vitek 2.0; e pela reação da polimerase emcadeia (PCR) com alvo no gene gluA. Nenhuma amostra apresentou contaminação por Cronobacterspp. Concluiu-se que a ocorrência de Cronobacter spp. em FID parece ser baixa, o que indica que osprodutores estão cumprindo o disposto nas normas brasileiras vigentes de forma a evitar a contaminaçãodos produtos por este micro-organismo...

Desenvolvimento de material de referência para microbiologia de alimentos contendo Listeria monocytogenes em matriz queijo / Development of reference material for food microbiology containing Listeria monocytogenes in matrix

A NBR ISO/IEC 17025:2005, uma das normas mais utilizadas em laboratórios de ensaio, descreve como um de seus critérios para a garantia da qualidade dos resultados analíticos a participação periódica dos laboratórios em ensaios de proficiência (EP). Os analitos, utilizados nos EP são materiais de referência (MR) provenientes de um mesmo lote, e devem apresentar características de homogeneidade e estabilidade. O objetivo deste estudo foi produzir um MR qualitativo destinado ao ensaio de pesquisa de Listeria monocytogenes em matriz queijo pela técnica de liofilização. Para a produção do MR, foi utilizado como matriz o queijo Minas frescal (QMF) ultrafiltrado. A matriz foi distribuída em frascos, contaminada com a bactéria alvo e submetida à liofilização, tendo a sacarose como crioprotetor. O MR produzido foi considerado homogêneo e estável na temperatura de ≤-70°C durante todo o período estudado (10 meses). O material apresentou estabilidade a 4, 25, 30 e 35°C por quatro dias e a -20°C por 48 dias, e os resultados estatísticos indicam tendência à estabilidade. Conclui-se que o material apresentou todos os requisitos necessários de um MR de qualidade e poderia ser transportado aos laboratórios participantes de um EP à temperatura máxima de 35°C por até quatro dias, uma vez que os resultados indicaram a manutenção da concentração celular nesse período. Esse foi o primeiro trabalho a descrever uma metodologia de produção de MR contendo L. monocytogenes em matriz queijo.

The standard most used in testing laboratories, ISO/IEC 17025:2005, describes the participation of laboratories in periodic proficiency testing (PT), as a criteria for quality assurance of analytical results. The analyses used in PT are reference materials (MR) from the same lot, and must have characteristics of homogeneity and stability. This study aimed to produce a qualitative RM for detection of Listeria monocytogenes assays in cheese matrix. For the production of RM, Minas Frescal cheese (MFQ) was used as matrix. The matrix was distributed in flasks, contaminated with the target bacteria and submitted to freeze-drying. Sucrose was used as cryoprotector. The RM produced was considered homogeneous and stable at -70°C during the entire period of study (10 months). The material showed stability at 4, 25, 30 and 35°C for 4 days and at -20°C the RM showed stability for 48 days, and the statistical results indicate a tendency to maintain stability. It was concluded that the material showed all the requirements of an RM quality and could be transported to the laboratory participants of a PT at 35°C up to 4 days, since the results indicate the maintenance of cell concentration during this period. This is the first study to describe a methodology for producing MR containing L. monocytogenes in cheese matrix.

Listeria monocytogenes em hortaliças: isolamento e sorotipagem / Listeria monocytogenes in green vegetables: isolation and serotyping

A ingestão de alimentos contaminados com Listeria monocytogenes representa um risco à saúde humana.A pesquisa de L. monocytogenes por meio de técnica de enriquecimento seletivo foi efetuada em 97amostras de hortaliças, comercializadas no Estado do Rio de Janeiro. Foram analisadas 35 hortaliças innatura, 32 minimamente processadas e 30 pratos de saladas cruas prontas para consumo. Os isoladosforam sorotipados por soroaglutinação clássica utilizando-se antissoro policlonal flagelar e somático.Sete amostras (7,2 %) apresentaram L. monocytogenes, sendo duas hortaliças in natura e cinco emforma de salada. Todos os isolados foram identificados como sorovar 1/2a. Em virtude da ocorrência decontaminação de hortaliças in natura com L. monocytogenes, é fundamental que os consumidores estejamesclarecidos quanto à possível presença deste patógeno nesse tipo de alimento, e ficarem cientes quantoà realização de corretos procedimentos de sanitização e de cuidados para evitar a contaminação cruzadacom outros alimentos. A presença de L. monocytogenes em saladas prontas para consumo representa umrisco à saúde dos consumidores, principalmente para indivíduos pertencentes ao grupo de risco.

Avaliação de crioprotetores na produção de material de referência para enumeração de coliformes em leite em pó a ser utilizado em ensaio de proficiência / Evaluation of cryoprotectants in the production of reference material for coliforms counting in milk powder to be used for proficiency testing

O desafio na produção de materiais de referência (MR) destinados a ensaios microbiológicos é ainstabilidade natural dos micro-organismos. A liofilização é indicada para criopreservação de culturasbacterianas quando o número de células deve ser resguardado. Agentes protetores podem ser adicionadosantes do congelamento para aumentar a estabilidade do material. Neste trabalho foram avaliados oscrioprotetores na produção de MR liofilizados a serem utilizados em ensaio de proficiência para contagemde coliformes. Foram produzidos quatro lotes utilizando-se diferentes crioprotetores: solução de leitedesnatado a 10 % (EC1), a mesma solução contendo glicerol (EC2), sacarose (EC3) e trealose (EC4). Umacepa de Escherichia coli foi empregada no preparo dos materiais. A homogeneidade foi avaliada conforme oProtocolo Internacional Harmonizado. A estabilidade foi estudada durante quatro meses à ≤ -70 ºC (longaduração) e às temperaturas de -20 ºC, 4 ºC, 25 ºC e 35 ºC durante cinco dias (curta duração), segundo aISO/GUIDE 35. Apenas EC1 foi considerado não homogêneo. Os lotes permaneceram estáveis à ≤ -70 ºCdurante quatro meses. EC2 apresentou resultados insatisfatórios na estabilidade de curta duração. EC3 eEC4 foram homogêneos e estáveis nas temperaturas estudadas. A sacarose e a trealose foram consideradascrioprotetores adequados para o preparo do MR em questão.

Comparação das técnicas do número mais provável (NMP) e de filtração em membrana na avaliação da qualidade microbiológica de água mineral natural / Comparison of most probable number (MNP) and membrane filtration techniques for analyzing the natural mineral water microbiological quality

O consumo de água mineral tem sido associado a um estilo de vida saudável e à crença, por parte dos consumidores, de que esse produto é relativamente seguro. A RDC n. 275/05 determina os padrões microbiológicos para água mineral natural e água natural no Brasil. Este trabalho teve como objetivo comparar as técnicas de filtração em membrana e de número mais provável (NMP) pela avaliação da qualidade microbiológica de amostras de água mineral natural envasilhadas em garrafões de 20 litros, comercializadas no Município do Rio de Janeiro, Brasil. Das 31 amostras representativas (no total de 155 unidades amostrais) analisadas, 22 (70,97%) apresentaram-se insatisfatórias em virtude de ocorrência de coliformes termotolerantes em duas (6,45%) amostras, independentemente da técnica utilizada. A contagem de coliformes totais acima do limite especificado foi evidenciada em três amostras (9,68%), de enterococos em uma amostra (3,23%), de P. aeruginosa em 21 (67,74%) e de clostrídios sulfito redutores em duas amostras (6,46%). A técnica do NMP apresentou maior sensibilidade na detecção dos grupos de micro-organismos relacionados na resolução supracitada. Portanto, esta técnica demonstrou ser mais eficiente para executar o controle da qualidade microbiológica de água potável.

Phenotypic profiles and detection of target genes by PCR in isolates from different sources and reference strains, identified as Cronobacter spp. (Enterobacter sakazakii)

Cronobacter, formerly known as Enterobacter sakazakii, is a novel genus of the Enterobacteriaceae family recognized as a cause of high number of fatal cases in neonates, after consuming infant formula. The conventional methods for detecting these organisms are time-consuming and lack sensitivity. The ISO/TS 22964:2006 is the most recently standardized methodology for detecting Cronobacter in powderedinfant formula. This study aimed at confirming the Brazilian isolates previously identified as E. sakazakiias Cronobacter spp. by biochemical assays, and also to compare characteristics of 37 Cronobacter andnon-Cronobacter isolates; and the miniaturized kits and the ISO/TS methodology were evaluated. A conventional PCR protocol targeting dna G was also developed and a previously described gluA targeting protocol was used. The majority of the Brazilian isolates were not confirmed as Cronobacter spp., and the selective enrichment step of ISO/TS methodology was inhibitory to some Cronobacter strains. The ID 32 Ewas the most reliable kit. The PCR protocol targeting gluA showed consistent results with ID 32E and the developed dnaG PCR protocol was 100% sensitive and specific. Thus, the PCR protocols targeting gluA and dnaG might be used to complement the Cronobacter spp. detection or identification after performing the conventional isolation and identification methods.

Desenvolvimento de material de referência para ensaio de proficiência em microbiologia de alimentos / Development of reference materials for proficiency tests in food microbiology

Ensaios de proficiência (EP) são considerados importantes ferramentas para a condução de programas controle de qualidade, que possibilitam efetuar a avaliação da habilidade de laboratórios em obter resultados precisos. No Brasil é restrita a oferta de EP na área de microbiologia de alimentos. Além disso, os altos custos diminuem a participação regular de laboratórios nacionais nesses ensaios. O presente estudo teve como objetivo realizar a avaliação da técnica de liofilização no preparo de materiais de referência (MR) para EP destinados ao ensaio de detecção de Salmonella spp. em leite. Foi determinada a concentração do inóculo utilizado no preparo de dois lotes e, também, foi padronizado o procedimento de contaminação da matriz. Para monitorar a qualidade dos MR produzidos foram estabelecidos ensaios de controle, dentre eles o teste da homogeneidade e da estabilidade em longo e curto prazo. A técnica de liofilização mostrou ser adequada para a produção de MR de qualidade e aplicável para EP. Os MR apresentaram estabilidade à temperatura de estoque (-20ºC) durante os três primeiros meses, porém foi observada perda de viabilidade após doze meses de armazenamento. Na estabilidade em curto prazo, os MR foram estáveis a 4°C, contudo apresentaram redução significativa no número de células quando mantidos a temperaturas de 25ºC e 37ºC durante sete dias.

Proficiency tests are considered relevant tools of quality control programs used to monitor the laboratory performance and to assess the reliability of tests results. In Brazil, the provision of proficiency testing (PT) is restricted to food microbiology area. Furthermore, high costs reduce the regular participationof national laboratories in these tests. This study evaluated the freeze-drying technique employed forpreparing reference materials (RM) to be used in the PT schemes for detecting Salmonella spp. in milk.The concentration of inoculums used for preparing two batches of RM was determined, and the proceduresfor matrix contamination were standardized. The control trials were established in order to monitor thequality of the produced RM, and among them, there are long and short-term homogeneity and stability assays. The freeze-drying technique proved to be a suitable procedure for producing RM for PT. The RM were stable for the first three months when stored at -20ºC, nevertheless, viability loss could be observed after 12-month storage. The RM were stable at 4°C at short-term stability, although when the products were kept at 25°C and 37°C for seven days, a significant reduction in the number of cells could be observed.